1. 연구개발 목표 및 내용
1) 최종목표 및 내용
◎ 인간 유도만능줄기세포 유래 오가노이드 기반의 유전성 망막질환 치료제 개발
● 최종 목표
인간 유도만능줄기세포 유래 오가노이드 기반의 유전성 망막질환 치료제 개발
○ 정상군 및 유전성 망막질환 환자의 iPCS 유래 오가노이드 확립
○ 망막 오가노이드 분화 단계별 분비 분자 프로파일링 (엑소좀 miRNA, 단백질) 및 망막질환 치료 후보 분자 발굴
○ 유효 분자의 치료 기전 탐색
○ 망막질환 오가노이드에 대한 유효 분자를 분비하는 오가노이드의 치료 효과 규명
● 전체 내용
1. 분화 단계별 정상군과 유전성 망막질환 환자 유래 오가노이드의 제작
○ 정상군 3명, 망막색소변성증 3명, 망막층간분리증 3명등 총 9명의 iPSC 유래 오가노이드 제작
○ 초기 (90일 배양), 중기 (120일), 후기 (150일 이상) iPCS 유래 망막오가노이드 각 27개씩 총 81개 구축
○ 분화 단계별 정상/질환 오가노이드의 분화 특성 확인
- 배양자의 현미경 관찰에 따른 오가노이드 형태 기반의 성숙화 및 완전성 정도 평가
- 면역형광염색을 통한 오가노이드 성숙화 및 광수용체 발현 평가
2. 질환별/분화 단계별 오가노이드 배양 상층액에서 치료효과를 보이는 후보 분비분자 도출
○ LC-MS와 small RNA-seq을 이용한 분화 시기별 오가노이드 배양 상층액의 분비 단백체 및 exosomal miRNA 프로파일링
○ 망막질환 오가노이드보다 정상군 오가노이드에서 발현이 증가된 단백질 및 miRNA 중 치료효과가 기대되는 후보 분자 발굴 (각 10종)
3. 최적의 치료효과를 보이는 오가노이드 획득 시기 확립
○ 치료 후보 분비분자의 함량이 가장 높은 최적의 배양 시기 선정 및 새로운 치료용 오가노이드 획득 (총 100) 및 검증
○ 신규로 제작된 정상 오가노이드의 배양상층액에서 유효 분비 분자 함량 확인
4. 망막질환 오가노이드와 치료효과를 보이는 정상 오가노이드의 공배양을 통한 망막질환 치료효과 확인
○ 분화 초기 질환 오가노이드 총 90개 제작 (RP 및 XLRS 각 45개)
○ 치료용 정상 오가노이드와의 공배양
○ 공배양 시기별 질환 오가노이드 형태분석 면역형광염색, 분자 프로파일링을 통해 질환 표현형 개선 효과 확인
5. 유효 분자의 치료기전 도출 및 확립
○ 유효한 치료제 후보 분자의 치료 기전 도출
- 정상 오가노이드 분비 단백질 및 엑소좀 miRNA의 조절 타겟 유전자의 gene ontology (biologycal process) 및 KEGG pathway, gene network 분석
○ 질환 망막 오가노이드 모델에 유효 분자 처리 후 분자 특성 및 표현형의 변화 확인
○ 유효한 치료제 후보 분자 처리 후 광수용체 세포 및 망막 신경세포 분화 관련 기전의 규명
6. 유전자 도입을 통한 유전성 망막질환 치료용 오가노이드의 기능 개선
○ AAV를 이용한 질환 오가노이드에 유효 치료 후보 유전자 도입 iPSC 2종 제작
○ CRISPR 유전자 가위를 이용한 유전성 망막질환 유발 돌연변이의 정상화 질환 오가노이드 총 2종 제작
○ 분화 시기별 정상화 질환 오가노이드 형태분석 면역형광염색, 분자 프로파일링을 통해 질환 표현형 개선 효과 확인
7. 기능개선 치료용 오가노이드와 질환 오가노이드의 공배양을 통한 망막질환 치료효과 확인
○ 획득한 치료용 유전자 도입/편집 오가노이드와 질환 오가노이드의 공배양 60건
○ 공배양 시기별 질환 오가노이드 형태분석 면역형광염색, 분자 프로파일링을 통해 질환 표현형 개선 효과 확인
8. 유전자 도입·편집된 치료용 오가노이드와 공배양한 질환 오가노이드의 유전자 발현 변화 확인
○ 치료용 오가노이드와 공배양된 질환 오가노이드에 대해 total RNA-seq 및 real-time PCR을 수행하여 광수용체세포 및 시신경세포 분화와 기능관련 유전자 변화를 확인 및 검증
○ 단독배양과 비교하여 발현이 변화한 유전자의 GO 및 network 분석과 망막 분화 및 기능 관련 유전자의 발현 확인
◎ (연구개발과제 1) : 망막질환 치료용 오가노이드의 확립 및 치료 효과 규명
● 최종 목표
유효 분자를 분비하는 망막질환 치료용 오가노이드의 확립 및 치료 효과 규명
○ 정상군과 유전성 망막질환 환자의 iPSC 유래 오가노이드 확립 및 배양 상층액 획득
○ 최적의 망막질환 치료 후보 오가노이드 획득 및 질환 오가노이드와의 공배양을 통한 치료효과 검증
○ 유전성 망막질환 치료용 오가노이드의 기능 개선 및 확립
● 전체 내용
연구개발 내용 1: 분화 단계별 정상군과 유전성 망막질환 환자 유래 오가노이드의 제작 및 배양 상층액 수집
○ 초기 iPCS 유래 망막오가노이드 27개 구축 (85〜95일 배양 오가노이드, 3 organoid/인3인/group3 groups (정상, RP, XLRS))
○ 중기 iPCS 유래 망막오가노이드 27개 구축 (115〜125일 배양 오가노이드, 3 organoid/인3인/group3 groups (정상, RP, XLRS)) = 27개)
○ 후기 iPCS 유래 망막오가노이드 27개 구축 (150일 이상 배양 오가노이드, 3 organoid/인3인/group3 groups (정상, RP, XLRS)) = 27개)
연구개발 내용 2: 분화 단계별 정상/질환 오가노이드의 분화 특성 확인
○ 배양자의 현미경 관찰에 따른 오가노이드 형태 기반의 성숙화 및 완전성 정도 평가
○ 면역형광염색을 통한 오가노이드 성숙화 및 광수용체 발현 평가 (HuC/D, Brn3b, CHX10, Hoechst® 33342)
연구개발 내용 3: 최적의 치료효과를 보이는 오가노이드 획득 시기 확립
○ 분비 분자 프로파일링으로 도출된 정상오가노이드 특이적 분비 분자의 함량이 가장 높은 최적의 배양 시기 선정 및 새로운 오가노이드 획득 (총 100개 = 2개 배양 조건 x 50개/조건)
○ 면역형광염색 및 형태학적 분석을 통한 신규 제작된 치료용 정상오가노이드의 10개의 분화정도 및 기능확인 (배양 조건별 각 5개 x 2개 배양조건)
○ 신규로 제작된 정상 오가노이드의 배양상층액 수집 (총 100건)
연구개발 내용 4: 망막질환 오가노이드와 치료효과를 보이는 정상 오가노이드의 공배양을 통한 망막질환 치료효과 확인
○ 분화 초기 질환 오가노이드 총 90개 제작 (RP 및 XLRS 각 45개)
○ ‘연구개발 내용 3’에서 획득한 치료용 정상 오가노이드와의 공배양
- RP 45개 (단독배양 15개, 후보 1 정상오가노이드와 공배양 15개, 후보 2 정상오가노이드 공배양 15개)
- XLRS 45개 (단독배양 15개, 후보 1 정상오가노이드와 공배양 15개, 후보 2 정상오가노이드 공배양 15개)
○ 공배양 시기별 질환 오가노이드 형태분석 면역형광염색, 분자 프로파일링을 통해 질환 표현형 개선 효과 확인
연구개발 내용 5: 유전자 도입을 통한 유전성 망막질환 치료용 오가노이드의 기능 개선
○ AAV를 이용한 질환 오가노이드에 유효 치료 후보 유전자 도입 iPSC 2종 제작
- 치료용 유전자도입 XLRS 오가노이드 1종
- 치료용 유전자도입 RP 오가노이드 1종
○ CRISPR 유전자 가위를 이용한 유전성 망막질환 유발 돌연변이의 정상화 질환 오가노이드 총 2종 제작
- 치료용 유전자 편집 XLRS 오가노이드 1종
- 치료용 유전자 편집 RP 오가노이드 1종
○ 분화 시기별 정상화 질환 오가노이드 형태분석 면역형광염색, 분자 프로파일링을 통해 질환 표현형 개선 효과 확인
연구개발 내용 6: 유전자 도입·편집된 치료용 오가노이드와 질환 오가노이드의 공배양을 통한 망막질환 치료효과 확인
○ 획득한 치료용 유전자 도입/편집 오가노이드와 질환 오가노이드의 공배양 60건
- RP 30개 (단독배양 10개, 유전자 도입 오가노이드와 공배양 10개, 유전자 편집 오가노이드와 공배양 10개)
- XLRS 30개 (단독배양 10개, 유전자 도입 오가노이드와 공배양 10개, 유전자 편집 오가노이드와 공배양 10개)
○ 공배양 시기별 질환 오가노이드 형태분석 면역형광염색, 분자 프로파일링을 통해 질환 표현형 개선 효과 확인
◎ (연구개발과제 2) : 망막질환 치료 후보 분자 발굴 및 유효 분자의 치료 기전 탐색
● 최종 목표
망막 오가노이드 분화 단계별 분비 분자 프로파일링 (엑소좀 miRNA, 단백질)을 통한 망막질환 치료 후보 분자 발굴 및 유효 분자의 치료 기전 탐색
○ [1차년도] 정상군과 유전성 망막질환 오가노이드 확립 및 분비 단백질과 exosomal miRNA의 프로파일링
○ [2차년도] 망막질환 환자유래 오가노이드를 이용한 치료제 후보 분비분자의 치료 기전 탐색
○ [3차년도] 유전성 망막질환 치료용 오가노이드의 치료 기전 확립
● 전체 내용
단백체 분석 기법을 이용한 질환별/분화 단계별 오가노이드 배양 상층액에서 분비된 단백질의 프로파일링
○ LC-MS를 이용한 분화 시기별 오가노이드 배양 상층액의 분비 단백체 profiling
- 초기 오가노이드 27개 9건 (정상군, XLRS, RP 각각 9개 오가노이드를 3개씩 pooling)
- 중기 오가노이드 27개 9건 (상동)
- 후기 오가노이드 27개 9건 (상동)
○ 형태학적, 면역형광염색으로 확인된 오가노이드 분화 평가 결과와 단백체 프로파일링 결과의 비교분석
○ 망막질환 오가노이드보다 정상군 오가노이드에서 발현이 증가된 단백질 발굴 (10종)
Small RNA-seq을 이용한 질환별/분화 단계별 오가노이드 배양 상층액에서 분비된 엑소좀 miRNA의 프로파일링
○ NGS를 이용한 분화 시기별 오가노이드 배양 상층액의 exosome 및 오가노이드 자체의 RNA profiling
- 초기 오가노이드 27개 9건 (정상군, XLRS, RP 각각 9개 오가노이드를 3개씩 pooling)
- 중기 오가노이드 27개 9건 (상동)
- 후기 오가노이드 27개 9건 (상동)
○ 형태학적, 면역형광염색으로 확인된 오가노이드 분화 평가 결과와 miRNA 프로파일링 결과의 비교분석
○ 망막질환 오가노이드보다 정상군 오가노이드에서 발현이 증가된 exosomal miRNA 발굴 (10 종)
치료용 정상오가노이드 배양 상층액에서 유효 분비 분자 함량 확인
○ 1세부 과제에서 제작된 치료용 정상오가노이드 배양상층액 100건에서 유효 치료제 후보 분자의 정량
- Exosomal miRNA 10종: Real-time PCR로 확인
- protein 10종: ELISA로 확인
○ 유효 후보 분자의 최대 농도를 분비하는 정상 오가노이드 60개 선별: 공배양을 통한 치료효과 탐색에 이용
유효 분자의 치료기전 도출 및 확립
○ 유효한 치료제 후보 분자의 치료 기전 도출
- 정상 오가노이드 분비 단백질 및 엑소좀 miRNA의 조절 타겟 유전자의 gene ontology (biologycal process) 및 KEGG pathway, gene network 분석을 통한 망막 분화 및 기능 관련 기전의 도출
- 1~2차년도에 확보된 오가노이드 조직절편에서 면역형광염색 및 in situ hybribization을 이용한 해당 기전 관련 유전자의 발현 양상 확인
○ 유효한 치료제 후보 분자의 분자 기전 확립: 질환 망막 오가노이드 모델에 유효 분자 처리 후 분자 특성 및 표현형의 변화 확인
- 유효 miRNA가 포함된 최적 exosome의 분리 및 농도별 처리 후 광수용체 세포 및 망막 신경세포의 분화 정도의 확인 및 추적 관찰
- 유효 단백질의 recombinant의 농도별 처리 후 광수용체 세포 및 망막신경세포의 분화 정도의 확인 및 추적 관찰
- 유효한 치료제 후보 분자 처리 후 광수용체 세포 및 망막 신경세포 분화 관련 기전의 규명 (Western blot, IHC, realtime PCR, in situ hybridization)
유전자 도입·편집된 치료용 오가노이드와 공배양한 질환 오가노이드의 유전자 발현 변화 확인
○ 치료용 오가노이드와 공배양된 질환 오가노이드에 대해 total RNA-seq 및 realtime-PCR을 수행하여 광수용체세포 및 시신경세포 분화와 기능관련 유전자 변화를 확인 및 검증
- RP 9건 (단독배양 3건, 유전자 도입 오가노이드와 공배양 3건, 유전자 편집 오가노이드와 공배양 3건)
- XLRS 9건 (단독배양 3건, 유전자 도입 오가노이드와 공배양 3건, 유전자 편집 오가노이드와 공배양 3건)
○ 단독배양과 비교하여 발현이 변화한 유전자의 GO 및 network 분석과 망막 분화 및 기능 관련 유전자의 발현 확인
(출처 : 요약문 2p)
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