국가연구개발성과

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단일세포 전사체 데이터 기반 유전성 암 임계전이의 수학적 모델링 및 핵심 분자네트워크 발굴

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등록번호 TRKO202500010869 발행년월 2024-01
발행기관명 국립암센터 발행국가/사용언어 대한민국 /국문
발주기관 한국보건산업진흥원 과제관리(전문)기관 한국보건산업진흥원
키워드 -
초록
1. 연구개발 목표 및 내용
1) 최종목표 및 내용
▣ 환자유래 단일세포 전사체 데이터 기반 유전성 암 임계전이 규명 및 이를 활용한 고위험군의 암 예방 후보물질 발굴
◎ 최종 목표
유전성 유방암이나 대장암등과 같이 잘 알려진 암 억제 유전자의 돌연변이를 물려받은 고위험군의 경우 예방적 절제수술 혹은 주기적 검진 외에 언젠가는 발생할 암을 막을 수 있는 효과적인 방법은 없음.
본 연구는 유전성 암 고위험군의 돌연변이를 가진 세포가 암화 되는 과정에서의 임계전이 변화를 분자적으로 규명하고 이를 제어할 수 있는 물질을 발굴 함으로써 유전성 암의 예방법을 제시하고자 함

◎ 전체 내용
본 연구는 유전성 암 중 가장 빈번한 것중 하나인 BRCA1 결손에 의한 유방암을 모델로 함

1. BRCA1 돌연변이 고위험군 오가노이드 및 환자유래 세포의 확보
- 단일세포 분석을 위한 오가노이드 배양조건 확립
- BRCA1돌연변이 고위험군의 정상 및 암 오가노이드 pair 5케이스 이상 확보

2. BRCA1의 Loss of heterozygosity 구현을 위한 유전자 가위 디자인 및 오가노이드에서의 최적화
- BRCA1의 wild type copy를 선택적으로 타겟하는 유전자 가위의 제작 및 검증
- 오가노이드에서 유전자 가위 도입시 시간에 따른 BRCA1의 결손 확인 및 단일세포 분석시료 확보

3. 단일세포 전사체 분석을 통한 BRCA1의 LOH과정에서의 암 임계전이 모델링
- 유전성 유방암 오가노이드 pair에 대한 단일세포 전사체 분석 및 임계전이 모델링
- 임계전이 과정에서의 핵심 분자네트워크 발굴 및 타겟 유전자 선별

4. BRCA1의 결핍에 의한 암 임계전이에서의 핵심 분자네트워크 기능검증
- 핵심 분자네트워크를 저해시 나타나는 LOH과정에서의 변화 규명
- BRCA1이 결손된 암세포에서의 핵심 분자네트워크의 기능 규명

5. 약물 유전체 데이터를 활용한 in-silico drug repositioning 으로 임계전이 제어물질 발굴
- LINCS 약물유전체 database를 이용하여 핵심 분자네트워크가 유도하는 발현패턴의 변화를 저해하는 물질 발굴
- BRCA1 손실에 의한 암 임계전이 모델에서 제어물질을 도입할 경우 나타나는 발현변화의 파급성 검증

6. BRCA1 결핍 오가노이드 및 환자유래 이종이식모델에서 임계전이 제어 약물후보의 유효성 평가
- 오가노이드 및 환자유래 세포에서 임계전이 제어 후보물질이 BRCA1 결핍시 나타나는 암화 과정을 막는지 검증
- 최종 선별된 물질의 임상적 유용성 검증 및 환자유래 이종이식모델에서유효성 평가

▣ (연구개발과제1) : 유전성 유방암 LOH 모델 구축 및 약물유전체 데이터 베이스를 이용한 임계전이 제어 후보물질 발굴
◎ 최종 목표
1세부과제의 목표는 2세부에서 수행할 BRCA1의 결손 시기에 나타나는 암 임계전이의 수학적 모델링 결과를 실험적으로 검증하여 어떤 세포들이 어떤 유전자들의 변화로 살아남아서 암화 되는지 규명하는 것임. 또한 이 과정에서 나타나는 핵심 네트워크 유전자들의 변화를 바탕으로 약물유전체 데이터 베이스를 검색, 이 과정을 제어하는 물질을 발굴하고 그 유효성을 평가하는 것을 목표로 함.

◎ 전체 내용
연구목표 달성을 위해 1세부는 아래와 같은 실험들을 수행하고자 함

1. BRCA1의 Loss of heterozygosity 구현을 위한 유전자 가위 디자인 및 오가노이드에서의 최적화
•BRCA1의 wild type copy를 선택적으로 타겟하는 유전자 가위의 제작 및 검증
•오가노이드에서 유전자 가위 도입시 시간에 따른 BRCA1의 결손 확인 및 단일세포 분석시료 확보

2. BRCA1 유전성 유방암 모델의 LOH과정에서의 기능적 변화 분석
•HR DNA repair reporter를 통한 BRCA1의 기능 모니터링
•세포주기 변화 및 암화의 기준이 되는 colony forming assay기법 최적화

3. BRCA1의 결핍에 의한 암 임계전이에서의 핵심 분자네트워크 기능검증
•핵심 분자네트워크를 저해시 나타나는 암화 지연 효과 규명
•BRCA1이 결손된 암세포에서의 핵심 분자네트워크의 필요성 규명

4. 암 임계전이 조절인자 중 신규성이 있는 약물타겟 유전자 도출
• cBioportal을 활용, BRCA1의 LOH과정에서 나타나는 임계전이 조절인자 중 암에서 비정상적 발현을 보이는 유전자 발굴
• 후보 유전자 중 약물로서 제어가 가능한 효소활성 조절 유전자 혹은 단백질의 구조가 알려진 유전자들을 선정

5. 약물 유전체 데이터를 활용한 in-silico drug repositioning 으로 임계전이 제어물질 발굴
• 단일세포 전사체 데이터를 통하여 임계전이를 넘은 세포와 그렇지 않은 세포간에 발현 차이가 큰 유전자들을 선별
• 이 유전자들을 입력데이터로 사용하여 약물유전체 탐색엔진인 L1000CDS tool에 적용함으로써 임계전이 제어 후보물질을 발굴

6. 암 임계전이 제어물질의 유효성 평가
• 오가노이드에서 후보물질을 처리시 위에서 확립된 암화 관련 기능분석을 통해 세포의 암화를 제어할 수 있는지 검증
• 환자유래 BRCA1 돌연변이 PDX모델 혹은 유방암 마우스 모델에서 후보물질의 암 억제 기능을 평가

▣ (연구개발과제2) : 단일세포 전사체 데이터 기반 유전성 암 임계전이의 수학적 모델링 및 핵심 분자네트워크 발굴
◎ 최종 목표
최근 인구의 고령화에 따라 의료 산업은 ‘질병 치료’를 넘어서 ‘건강 수명의 시대’로 초점이 맞춰지고 있다. 단순히 오래 사는 것이 아니라 건강하게 오래 사는 ‘건강수명’을 연장하기 위해 치료의 범위가 확장되고 있으며, 특히 유전성 암환자의 경우, 암 발생을 미리 억제하여 의료비 지출을 경감하고 건강수명을 연장하고자 하는 미충족 의료 수요가 증가하고 있는 실정이다.
본 연구팀은 정상세포에서 암세포가 발생하는 시점의 암 임계전이 상태(tumor transition state)를 수학적으로 모델링하고 동역학 분석을 통하여 암을 억제하기 위한 핵심 제어 타겟을 발굴할 수 있는 기술을 보유하고 있다.
이러한 기술을, BRAC1 돌연변이 고위험군 환자의 오가노이드 및 환자유래 이종이식모델의 LOH 과정에서 확보한 단일세포 데이터(1, 3세부과제)에 적용하여 유전성 암 발생과정의 임계전이를 저해할 수 있는 핵심 저해 타겟 유전자를 발굴하고자 한다.
또한, 발굴한 타겟 유전자에 대한 가상 약물 처리 시뮬레이션 결과 데이터를 1세부와 공유하여 약물 유전체 데이터베이스를 활용한 임계전이 제어 물질 후보 발굴에 기여하고 제어 물질의 작용기전을 암 임계전이 수학 모델을 통하여 밝히고자 한다. 본 연구팀이 개발할 유전성 암 임계전이 제어 물질 발굴 기술은 추후 유방암 뿐만 아니라, 대장암 등의 여타 유전성 암에 적용하여 예방 약물을 발굴하는 데에 범용적으로 활용될 수 있을 것이다.

◎ 전체 내용
• 공개데이터 기반 BRCA1 발현 변화에 대한 전사변화 추적 및 암 임계전이 상태의 수학적 모델링
- 유전성 유방암 관련 단일세포 전사체 공개데이터 수집
- BRCA1 발현 변화에 따른 단일세포 전사변화 추적
- 암 임계전이 상태의 동정 및 분자 네트워크 모델 구축
• 암 임계전이 상태의 동역학 특성 분석 및 제어 타겟 유전자 후보 발굴.
- 암 임계전이 네트워크 모델의 동역학 특성 분석
- 유전자 섭동 분석을 통한 제어 타겟 유전자 후보 발굴
- BRCA1 손실에 따른 제어 타겟 유전자의 효과 분석
• BRCA1 결핍 오가노이드 모델의 단일세포 분석을 통한 유전성 유방암 임계전이 상태의 수학적 모델링
- BRCA1 결핍 오가노이드 모델에 대한 암화 과정의 단일세포 데이터를 이용한 단일세포 전사변화 추적
- 유전성 유방암 발달 궤적 추적 및 임계전이 상태 동정
- 암 임계전이 상태의 분자 네트워크의 수학 모델 구축
• 암 임계전이 상태의 동역학 분석을 통한 핵심 분자네트워크 발굴 및 제어 타겟 유전자 선별
- 암 임계전이 네트워크 모델의 끌개 분석을 통한 핵심 분자네트워크 발굴
- 핵심 분자네트워크 제어를 위한 최적 제어 타겟 유전자 선별
- 타겟 유전자 제어에 따른 임계전이 모델의 표현형 변화 분석
• 약물 데이터베이스를 활용한 암 임계전이 제어 타겟 유전자의 약물 후보 탐색
- 표현형 변화 분석을 통해 최적의 단일/조합 제어 타겟 발굴
- 약물-타겟 데이터베이스를 통한 최적 약물 후보 선별
• 암 예방 제어물질의 효과 시뮬레이션을 통한 최적 저해 물질의 작용기전 분석
- 제어 타겟 유전자의 단일/조합 섭동 시뮬레이션을 통한 유전자 발현 변화 데이터 생성 및 1세부 제공
- 암 예방을 위한 제어 물질의 효과 시뮬레이션을 통한 표현형 변화 분석과 암 예방 작용기전 분석

▣ (연구개발과제3) : 유전성 유방암 오가노이드 확보 및 임계전이 핵심네트워크 인자의 임상적용성 검증
◎ 최종 목표
1. 최종 목표
: 유전성 유방암 환자 유래의 정상/암 오가노이드 및 이종이식모델을 이용한 암 임계전이 발현 기전 규명 및 약물 타켓으로서의 임상적 유용성 검증

2. 단계별 목표
1) 1단계 목표
□ BRCA1 돌연변이 고위험군 오가노이드 및 환자유래 세포의 확보
○ 단일세포 분석을 위한 배양조건 확립
○ BRCA1돌연변이 고위험군의 정상 및 암 오가노이드 pair 5케이스 이상 확보
2) 2단계 목표
□ BRCA1 돌연변이 고위험군 환자유래 이종이식모델의 확보 및 분자적 분석
○ BRCA1 돌연변이 고위험군 환자유래 이종이식모델의 5 케이스 이상 확보
3) 3단계 목표
□ Tissue microarray를 통한 암 임계전이 핵심 분자들의 발현추적 및 약물타겟으로서의 임상적 유용성 평가
○ Tissue microarray를 통한 암 임계전이 핵심 분자들의 발현추적
○ 최종 선별된 물질의 임상적 유용성 및 환자유래 이종이식모델에서 유효성 평가
○ 유방암 오가노이드 단독 및 각 정상조직들과의 Co-culture 플랫폼에서 약물반응성 평가

◎ 전체 내용
1. 대상자 선정기준 및 제외기준
<선정기준>
: 유방의 정상 조직 확보가 가능한 환자
1) 유방암으로 수술 및 보조전신치료 등의 표준치료 시행한 환자
2) Normal fresh tissue를 얻을 수 있을 것으로 판단된 환자
3) 기저질환, 임상병리학적 정보, 재발/전이 여부 확보가 가능

<제외기준>
1) 샘플채취에 취약한 장애인, 임산부, 노인
2) 20세 미만 환자

2. 연구설계 및 방법
#1. 확보할 조직
1) 유방 정상조직, 유방암 조직
2) Caner등의 surgery로 인해 정상 조직의 확보가 가능한 환자를 수술검체에서 fresh tissue를 확보

#2. 환자 유래 오가노이드 수립
- 유방암 및 매칭되는 유방 정상조직 오가노이드 pair 각 5례씩 수립

- < Organoid culture >
1. Tissue wash
2. tissue chopping
3. 15ml tube에 dissociation buffer 5ml + tissue 넣음 → 37℃, 1-2h shaking
4. 100um filter로 tissue 걸러줌
5. 4℃, 80g, 3min → centrifuge
6. Sup 제거 → HF 10ml 넣어줌
7. 1200rpm, 5min → centrifuge
8. ※ Sup 제거 후, red blood cell 있으면 red blood cell lysis buffer 2ml 넣음 → RT, 5min → medium 추가후 centrifuge
9. Sup 제거 → medium 1ml 넣어줌
10. Counting
11. 1000cells/ul로 맞춤
12. ex)120ul에 120k → 12ul로 10개 seeding
13. 1200rpm, 5min → centrifuge
14. Sup 제거 → BME 130ul (10개 기준) 넣고 12ul씩 seeding (24well)
15. 37℃, 5-10min
16. Organoid Growth Medium 500ul 넣어줌
17. 4일에 한번씩 media change

#3. 유방암 오가노이드, 정상 장기들과의 co-culture system에서의 약물반응성 평가
- 유방암 전신치료의 근간을 이루고 있는 항호르몬치료제제 및 cytotoxic agents들을 유방암
오가노이드 5례에 개별적으로 평가 → 각 약물 별 반응성 분석.
- 유방암 오가노이드 5례와 각 정상 장기를 co-culture 하면서 약물처리 - tumor formation의 영향을, control과 비교하여 원격전이 발병 억제, 즉 보조요법으로의 치료반응성을 평가

#4. BRCA1 돌연변이 고위험군 환자유래 이종이식모델의 5 케이스 이상 확보
- PDX (patient-derived xenografts) 또는 PDTX (patient-derived tumor xenografts)는 환자 유래 암조직 이종 이식 기반 전임상 모델로 환자로부터 얻어진 primary tumor를 면역이 억제된mouse에 직접 이식하는 동물모델임
- BRCA1 돌연변이 고위험군 환자유래 이종이식모델의 5 케이스 구축

#5. Tissue microarray를 통한 암 임계전이 핵심 분자들의 발현추적 및 약물타겟으로서의 임상적 유용성 평가
- Tissue microarray를 통한 암 임계전이 핵심 분자들의 발현을 추적하여, 임상적 유용성 검증
- 최종 선별된 물질의 환자유래 이종이식모델에서 유효성을 평가하여, 임상적 실효성 검증

3. 평가항목
#1. 기본정보
유방암 진단 유무/검진 대상 유무, 연령 (유방암 진단 시점 혹은 검진 시점), 신장/체중(cm/kg), 유방질환 조직 검사 병력, 암 병력, 초경 나이, 폐경 유무 (폐경 시 폐경 나이), 호르몬치료 유무 및 시기, 결혼 유무, 자녀 유무, 첫 분만 나이, 모유수유 유무/기간, 마지막 유방 검진 시점 및 방법

#2. 가족력
유방암 및 난소암에 대한 가족력, Number of affected relatives, Degree of affected relatives, Age at diagnosis, BRCA tested 유무/결과

#3. 유방암
수술일, 수술 방법, 환측, 선행항암유무, 크기/림프절 개수, ER/PR/HER2/Ki67 (%), 방사사선 치료/항호르몬치료/항암치료, 재발/사망

(출처 : 요약문 3p)

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