연구보고서
유전자 편집기술을 이용한 적혈구 생산용 가역적 불멸화 세포주 개발
(Development of reversible immortalized cell line for red blood cell production using gene editing technology)
□ 연구개발 목표 및 내용
ㆍ 최종 목표
‣ 저출산과 고령화로 헌혈 인구가 줄면서 헌혈을 통한 혈액 수급이 매우 제한적이어서 가장 큰 문제점으로 부각되고 있음
‣ 현실적으로 병원 내에서 대량의 혈액을 보관하고 유지가 어렵기 때문에 인공혈액 생산을 통하여 필요한 시점에 필요한 양의 혈액을 생산하면 이런 문제점을 극복 할 수 있음
‣ 이를 극복하기 위해 유전자편집을 통해 모든 환자에게 이식이 가능하며 대량 생산이 가능한 전구세포를 제작하여 필요할 때 마다 혈구세포로 분화시키는 기술개발이 중요함
‣ 본 연구개발의 최종목표는 모든 사람에게 수혈이 가능한 가역적인 불멸화 조혈모 세포주 (reversibly immortalized hematopoietic stem cell)를 제작하고 이 세포주로부터 효율적인 적혈구로의 분화를 통하여 인공혈액 생산 기반 기술을 확립함
ㆍ 전체 내용
[1차년도]
‣ Rh-, O형인 혈액을 이용하여 iPSC 제작 및 성상분석
• Rh-, O형인 iPSC 제작(Universal donor hPSC1)
• 제작한 iPSC의 전분화능 유지 여부 및 염색체 이상 여부 분석
‣ hESC에서 FUT1와 RhD 유전자를 knock-out 시킨 hESC 제작(Universal donor hPSC2)
• CRISPR Cas9을 이용하여 hESC에서 FUT1, RhD 유전자를 knock-out 시킨 세포주 제작
• 제작된 FUT1, RhD knock-out 세포주에서 해당 단백질 미발현 확인
‣ 제작된 universal donor 전분화능줄기세포에 iCas9 유전자와 tet-inducible TERT 유전자를 knock-in 시킨 세포주 제작
• Homologous recombination (HDR)에 의한 knock-in용 플라스미드 제작
• HDR 유전자 편집을 통해 knock-in hPSC 제작
• 제작한 세포주에서 iCas9과 TERT 유전자 발현 여부를 확인함
‣ 위에서 제작된 knock-in 전분화능줄기세포를 조혈모세포로 분화시킨 후 불멸화 유도
• 전분화능줄기세포를 조혈모세포로 분화
• 분화된 조혈모세포 배양시 doxycycline을 처리하여 TERT를 발현시킴으로서 (가역적) 불멸화 조혈모세포의 제작
[2차년도]
‣ 제작 된 가역적 불멸화 조혈모세포의 증식능 분석
• Doxycycline 처리 상태에서 계대 별로 cell counting을 통해 증식능 확인
‣ 제작 된 조혈모세포의 가역성 검증(안전성 평가1)
• Doxycycline 제거 후 불멸화 조혈모세포가 가역적으로 정상세포로 돌아가는지 여부 확인
‣ 가역적 불멸화 조혈모세포에서 iCas9 suicide gene system 작동 여부 검증(안전성 평가2)
• 제작된 조혈모세포에서 ap1903 약물을 처리하여 세포 사멸 여부를 확인
‣ 가역적 불멸화 조혈모세포로부터 적혈구 분화 유도
• Doxycycline을 제거하여 TERT 유전자 발현을 중지시킨 후 적혈구로의 분화 유도
‣ 분화된 적혈구 세포의 응집 반응 분석을 통한 수혈면역적 유효성 검증
• 적혈구로 분화 후 ABO와 Rh에 대한 혈구응집 반응 분석
□ 연구개발성과
○ 유전자 편집을 이용해서 적혈구 대량 생산이 가능한 전구세포주 수립
‣ 1단계(2년): 2023-2024년
• hPSC의 유전자편집을 통해 모든 사람에게 이식이 가능한 불멸화 조혈모세포주를 확립하고 이들의 증식능과 안전성을 검증함
• 제작한 가역적 불멸화 조혈모세포주로부터 효율적인 적혈구로의 분화 및 수혈면역적 유효성 검증을 통하여 인공혈액 생산 기반 기술을 확립함
• SCI 논문(JCR 분야별 상위 20% 이내) 1편 이상과 적혈구 생산용 불멸화 세포주 확립 2건으로 국내특허 출원 1건 이상 및 국가줄기세포은행에 기탁
□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
○ 활용 방안
‣ Universal donor 전분화능줄기세포로부터 유전자편집을 이용하여 최적화된 불멸화 조혈모세포를 제작할 수 있는 원천기술이 개발된다면 우리나라 국민 뿐 만 아니라 전 세계인들이 적은 비용으로 빠른 시간 내에 혈액공급을 받을 수 있는 길이 열리게 됨
‣ 이 원천기술로 제작된 불멸화 조혈모세포를 이용하여 암, 혈액 장애, 면역 장애 등 다양한 질병의 치료방법을 개발에 사용할 수 있으며 기존 치료법의 한계를 극복할 수 있는 대안으로 사용될 수 있음
‣ 또한, 면역시스템의 작동원리와 면역반응에 대한 연구를 통해 면역 질환의 이해와 치료법의 발전에 도움을 줌으로써 새로운 예방접종 및 면역 치료법 개발에 기여할 수 있음
‣ 약물 시험에 사용되는 기존의 동물 모델 대신, 불멸화된 조혈모세포로 구성된 인공혈액을 사용하여 약물의 효과와 안전성을 평가할 수 있으며 이는 더욱 정확하고 윤리적인 약물 개발을 돕는데 도움이 될 수 있음
‣ 유전자편집을 이용하여 면역반응에 관여한다고 생각하는 주요 적혈구 항원 유전자들을 특이적으로 교정하고 불멸화 유전자를 도입함으로써 유전자들이 인간 면역반응에 어떻게 영향을 미치는지를 깊게 이해할 수 있어, 이식면역 분야를 한 단계 더 발전시킬 수 있는 단초를 제공함
○ 기대 효과
‣ 과학적 기술적 측면
• 질병 치료의 혁신: 불멸화된 조혈모세포를 활용한 세포 기반 인공혈액은 암, 혈액 장애, 면역장애 등 다양한 질병의 치료에 새로운 가능성을 열어줄 수 있으며 이는 기존 치료법의 한계를 극복하고 환자의 생존율을 향상시킬 수 있는 혁신적인 접근 방식을 제공함
• 면역 시스템 연구의 진보: 불멸화된 조혈모세포를 사용하여 면역 시스템의 작동 원리와 면역 반응에 대한 연구를 수행할 수 있으며 이는 면역 질환의 이해와 치료법 개발에 도움이 됨
‣ 경제 산업적 측면
• 의료 비용 절감: 불멸화된 조혈모세포를 사용한 세포 기반 인공혈액은 혈액 수혈의 필요성을 줄이고, 혈액 장애 치료 및 장기 이식에서의 합병증을 감소시킬 수 있으며 이는 의료 비용을 절감하고 환자들에게 더 나은 치료 옵션을 제공할 수 있음
• 새로운 산업 분야의 형성: 불멸화된 조혈모세포의 연구개발 성과는 세포 기반 인공혈액의 생산과 관련된 새로운 산업 분야의 형성을 이끌어낼 수 있으며 이는 생명과학, 의료 기기 및 제약 등의 분야에서 새로운 기회와 경제적 성장을 가져올 수 있음
(출처 : 요약문 5p)
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관련 정보
과제
만능공여형 적혈구전구세포주 제작 및 탈핵 증진 연구
2022/한양대학교 /165.00 백만원
논문
Genome Editing in Stem Cells for Disease Therapeutics
