국가연구개발성과

연구보고서
mRNA 백신의 생체 내 반감기 증가를 위한 신개념 효소 창출 (Creating new-to-nature enzymes to prolong the half-life of mRNA vaccine)

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등록번호 TRKO202500010650 발행년월 2025-01
발행기관명 한국과학기술원 발행국가/사용언어 대한민국 /국문
발주기관 한국과학기술원 과제관리(전문)기관 한국과학기술원
키워드 mRNA 캡;계산적 단백질 디자인;mRNA 백신;단백질 구조;효소 기반 mRNA 백신 생산 과정;
mRNA cap;Computational protein design;mRNA vaccine;mRNA vaccine;Enzymatic mRNA vaccine production process;
초록
□ 연구개발 목표 및 내용
ㆍ 최종 목표
인공 RTPase, GTase 효소를 사용한 새로운 7-methylguanosine capping 방법은 mRNA therapeutics에 획기적인 변화를 가져다줄 것이다. 변형된 7-methylguanosine cap 구조를 갖는 mRNA는 DCP에 의해 분해되지 않고 ribosome에 의한 단백질 생합성에는 영향을 미치지 않을 것이기 때문이다. 즉, mRNA의 안정성이 확보되어 적은 양의 mRNA로부터 단백질 발현이 크게 증대될 것이다.
ㆍ 전체 내용
본 연구는 mRNA 의 half-life 를 연장하기 위해 기존의 7-methylguanosine triphosphate linker cap 구조를 diphosphate linker cap 구조로 대체하는 전략을 제안하였다. 이러한 구조적 변화는 decapping enzyme(DCP)에 의한 cap 가수분해를 방지하여 mRNA 안정성을 높이고, 결과적으로 생체 내에서 번역 효율을 향상시킬 수 있을 것으로 기대하였다.
7-methylguanosine cap 구조에 대한 분석 결과, triphosphate linker를 diphosphate linker로 변형하더 라도 eIF4E와 CBP(cap binding protein)와의 결합에는 영향을 주지 않는 반면, DCP와의 결합에서는 steric dash가 발생하여 결합이 불가능할 것으로 예측되었다. 이를 통해 diphosphate linker cap 구조는 DCP에 의해 가수분해되지 않을 가능성이 높은 것으로 판단되었다.
이를 구현하기 위해 기존의 coping 과정을 기반으로 새로운 enzyme 설계를 시도하였다. 일반적으로 capping 은 RNA triphosphatase CRTPase), guanylyltransf erase (GTase), 그리고 methyltransf erased 의해 단계적으로 진행되며, 최종적으로 triphosphate linker cap 구조가 형성된다. 본 연구에서는 RTPase와 GTase를 재설계하여 diphosphate linker를 가진 cap 구조를 생성할 수 있도록 설계를 진행하였다.
새롭게 설계된 RTPase는 기존 효소의 활성 부위를 유지하면서 pppNp-RNA를 교귀교-태쇼로 변환할 수 있도록 protein backbone과 서열을 computational protein design 기법을 통해 재구성하였다. 또한, 이러한 p-Np-RNA를 기질로 인식하여 diphosphate linker cap 구조를 형성할 수 있는 GTase를 추가로 설계하였다, 설계된 enzyme의 구조적 안정성과 기능적 활성은 AlphaFold3와 같은 protein prediction tool을 활용하여 예측 및 검증하였다.
diphosphate formed cap(m7GppA cap)의 유효성을 평가하기 위해 다양한 가설 검증 실험을 수행하였다. 먼저, expression test와 eIF4E binding test 를 통해 m7GppA cap이 mRNA의 유전자 발현과 translation 개시에 필요한 기본적인 기능을 수행할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 m7GppA cap이 mRNA cap으로서 기능을 할 수 있는 가능성을 제시하며, cap analog로서의 활용 가능성을 뒷받침하였다. 그러나 안정성 측정을 위한 가장 중요한 단계인 stability test에서, m7GppA capped mRNA가 DCP에 의해 decapping 되는 것을 확인하였다. 이 결과는 m7GppA cap이 long-lasting mRNA 백신 개발에 필요한 안정성을 제공하지 못한다는 점을 명확히 증명하였다. 따라서 m7GppA cap은 지속 가능한 mRNA 백신의 cap 구조로 활용하기에 부적합하다는 결론에 이르게 되었다.
결과적으로, 본 연구를 통해 m7GppA cap의 장점과 한계를 종합적으로 평가하였으며, 이를 기반으로 안정성이 강화된 cap analog 설계를 위한 향후 연구 방향을 구체화하고, 새로운 접근법을 모색하는 데 있어 귀중한 경험과 데이터를 제공한 의미 있는 시행착오로 판단한다.

(출처 : 요약문 3p)

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