▣ 연구개발 목표 및 내용
◼ 최종 목표
RNA 가공과 분해에 중추적인 역할을 하는 필수적 RNA 내부분해효소 RNase E의 효소 활성을 증대시키는 새로운 인자 발굴 및 기질 특이적 인자와의 상호 조절 기작을 규명하고, 병원성 세균에서의 기질 특이적 다량체 구조 분석을 통하여 세포내·외 환경 변화에 따른 RNase E의 총체적 유전자 발현제어 기전을 규명하고자 한다.
◼ 전체 내용
□ RNase E 효소 활성 증대 인자 AmiC 단백질 정제 및 발현 분석을 위한 항체 제작
■ western blot assay를 활용하여 AmiC 단백질의 정제 및 발현양 비교를 위하여 BL21(DE3) + pET30a-amiC 균주를 제작한 후 AmiC 단백질을 발현시킨다.
■ 이 후 AmiC 단백질을 정제하여 Rabbit에 injection 후 약 6-8주간 immunization 과정을 거치고 serum을 분리하여 항체를 정제한다.
■ 새로 규명한 trans acting 인자도 같은 방법으로 정제하여 항체를 제작한다.
□ CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 AmiC 유전자 결실 균주 제작 및 transcriptome 분석
■ 최근 특정 유전자를 knockout 시키는 방법으로 활발하게 활용되고 있는 CRISPR/Cas9 system을 활용하여 AmiC 유전자가 결실된 균주 (W3110 ΔamiC) 및 AmiC 기능이 복구된 complementary 균주(W3110 ΔamiC + pSC101-amiC)를 각각 제작한다. 완성된 균주는 sequencing 및 western blot 등을 이용하여 검증한다.
■ 검증된 각 균주를 활용하여 AmiC에 의해 조절되는 하위 전사체들을 규명하기 위하여 RNA-seq. method를 통한 transcriptome 분석을 진행한다.
□ 기질에 따른 trans acting 인자의 멀티머 형성 효율 및 세포내 위치 (cellular localization) 확인
■ W3110 ΔamiC 및 complementary 균주(W3110 ΔamiC + pSC101-amiC)에 NTH-RNase E 발현 벡터를 transformation한 후, S30 세포추출액 및 NTH-Rne 단백질을 정제한다.
■ 각 단백질 40 pmol을 gel filtration 및 254 nm UV light를 이용하여 crosslinking 시킨다. 일정 시간 이후 동량의 protein loading buffer를 넣어 10% SDS-PAGE에 loading 한다.
■ stress condition에서 RNase E및 trans acting 인자의 타겟 유전자 발현 변화를 qRT-PCR, western blot 등으로 확인하고, fluorescent labeling한 NTH-Rne 및 AmiC 단백질을 이용한 confocal microscopy 실험을 통하여 세포내 위치 확인한다.
□ 발굴된 trans acting 인자를 병원성 세균의 동족체에 발현시켰을 때 병원성에 미치는 영향 분석
■ 전년도 연구를 통해 새롭게 발굴한 trans acting 인자를 비브리오(Vibrio vulnificus) 또는 살모넬라 (Salmonella typhimurium) 등 병원성 세균에서 발현시킨 후 RNase E의 효소 활성 및 멀티머 형성 변화를 확인한다.
■ 이후 소동물 (mouse, rat) 감염 모델을 이용하여 병원성을 측정한다.
◼ 1단계
❏ 목표
RNA 내부분해효소 RNase E의 효소 활성을 증대시키는 새로운 인자 발굴 및 기질 특이적 인자와의 상호 조절 기작을 규명하고, 병원성 세균에서의 기질 특이적 다량체 구조 분석을 통하여 세포내·외 환경 변화에 따른 RNase E의 총체적 유전자 발현제어 기전을 규명
❏ 내용
▶ 새로운 RNase E 멀티머 증대 인자 발굴 시스템 구축
▶ bioinformatical 분석을 통한 효소 활성 증대 인자 library 구축
▶ domain mapping을 통한 활성 증대 인자와 RNase E의 결합 부위 확인
▶ 활성 증대 인자와 NTH-RNase E 결합 구조분석을 통한 멀티머 형성 및 결합 구조 모델링
▶ Full-length RNase E에 대한 활성 증대 인자 효과 분석
▶ CRISPR/Cas9 시스템을 활용한 trans acting 인자 결실균주 및 과발현 균주 제작 및 기능 검증
▶ trans acting 인자 하위 조절 인자 규명을 위한 transcriptome 분석
▶ 물리 화학적 및 영양학적 환경변화에 따른 trans acting 인자의 발현 및 RNase E 멀티머 형성, 효소 활성 확인
▶ 환경 변화에 따른 substrate selectivity 효능 검증
▶ 스트레스 요인에 따른 substrate 및 RNase E-trans acting 인자의 세포내 위치 변화 확인
▶ 비브리오 균주 (Vibrio vulnificus)에서의 RNase E 멀티머 형성 및 trans acting 인자에 의한 RNase E 효소 활성 비교
▶ 살모넬라 균주 (Salmonella typhimurium)에서의 RNase E 멀티머 형성 및 trans acting 인자에 의한 RNase E 효소 활성 비교
▶ 각 균주에서의 환경 변화에 따른 substrate selectivity 효능 및 세포내 위치 변화 확인
▶ 소동물 (mouse, rat) 모델에서 trans acting 인자의 발현 및 RNase E 멀티머 변화가 병원성에 미치는 영향 측정
▣ 연구개발성과
○ 멀티머 형성을 증대시키는 trans acting 인자 발굴 및 library 구축
○ 발굴된 trans acting 인자의 시험관내 RNase E효소 활성 및 분해 기전 검증
○ 발굴된 trans acting 인자를 병원성 세균의 동족체에 발현시켰을 때 병원성에 미치는 영향 분석
▣ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
○ 본 연구수행을 통한 개발 성과는 기존에 알지 못했던 RNA 분해효소에 의해 RNA의 길이에 따라 다르게 안정성을 조절하는 기전을 규명하였다는 점에서 의미가 있으며, 길이가 긴 RNA 생존기간을 연장시킬 수 있는 원리를 규명하였다는 점에서 의미가 있다.
○ 이는 최근 떠오르고 있는 RNA 백신을 포함한 RNA 치료제 개발의 핵심 난제인 RNA 안정성 조절 기전을 규명하기 위한 새로운 단서를 제공한 의미 있는 연구라고 할 수 있으며, RNA의 안정성을 증대시키는 modification 등의 응용을 통해 RNA 치료제 개발 연구에 활용될 수 있다.
2) 연구개발성과의 기대효과
○ 본 연구를 통하여 RNase E의 새로운 결합 인자 및 조절 기작이 규명된다면 특정한 RNA를 성숙 또는 분해시키는 데 있어서, RNA 내부분해효소의 활성이 어떠한 기작으로 조절되는지, 어떠한 유발 인자(trigger)에 의해 이 효소가 RNA를 성숙 또는 분해시키는 것을 결정하는지 등에 대한 생물학적 이해를 증진시키는데 기여한다. 또한 다양한 질환의 원인 분자를 표적으로 진단제와 치료제로 개발할 수 있고 나아가 RNA 분해 및 가공에 대한 이해 증진을 통하여 병원성 미생물을 제어할 수 있는 새로운 타겟 및 치료제 개발로의 연구에도 기여할 수 있다.
(출처 : 요약문 2p)
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