비바이러스성 유전자 치료제의 한계를 극복하기 위해 1) 기질 리보핵산(Dicer substrate RNA and synthetic mRNA)의 화학적/물리적 구조에 대한 연구를 진행하여 세포 내 단백질과의 상호작용을 최적화하고, 2) 기질 리보핵산의 생체 내 전달을 위해 생분해성 이온화 지질 나노입자(ionizable solid lipid nanoparticles)를 개발 하여 혁신적 유전자 치료 효과를 얻는 것을 최종목표로 한다.세부목표는 다음과 같다.◎ 다이서 기질 리보핵산 구조체의 화학적/물리적 구조 변경을 통한 단백질과의 상호작용 평가.◎ 다이서 기질 리보핵산 구조체의 향상된 in vitro 및 in vivo 유전자 침묵효과 확보.◎ 리보좀 기질 합성 mRNA (in vitro transcripted mRNA) 제작 및 세포 내 다중 단백질 발현 확인.◎ 합성 mRNA의 화학적/물리적 구조 변경을 통한 장기적인 단백질 발현(long term expression) 시스템 개발. ◎ 기질 리보핵산의 세포 내 전달을 위한 생분해성(bioreducible) 이온화 지질 합성 및 세포 독성 평가.◎ 초미세유체장치를 이용한 이온화 지질 나노입자 포뮬레이션 개발 및 고효율의 기질 리보핵산 봉입률 확보. ◎ 이온화 지질 나노입자의 물리적 특성 및 생물학적 리간드 수식을 이용한 체내 선택적 전달기술 개발.◎ 기질 리보핵산 전달을 통한 유전자 억제 및 발현에 따른 치료효과를 소동물 실험을 통해 확인.

연차별 연구내용은 다음과 같다.1차년도◎ 다이서 기질로서의 리보핵산 구조체의 조건 확립 ◎ Thermal Annealing을 통한 리보핵산 구조체 제작◎ 기질 리보핵산 구조체의 다이서 프로세싱 여부 확인 ◎ Fluorescence polarization(FP) assay를 통한 기질 리보핵산과 단백질 간의 결합 확인◎ FP assay를 기반으로 한 리보핵산 구조의 화학적 변형 패턴 및 물리적 구조 최적화를 통한 침묵효능 극대화◎ In vitro 세포 실험을 통한 안정성 및 침묵효능 평가◎ 다양한 종류의 5' CAP, 5' 3'-UTR, poly A tail을 가진 mRNA 구조 연구 및 라이브러리 구축◎ 다중 단백질 전사를 위한 IRES 서열 및 2A peptide 서열의 스크리닝 및 최적 서열 확보◎ IVT mRNA의 다중 단백질 전사 효율을 in vitro에서 검증◎ mRNA의 세포 내 안정도 증가 및 면역 반응 조절을 위한 chem. modified rNTP 적용 ◎ 세포 내 단백질 발현을 장기간 지속하기 위한 새로운 합성 mRNA의 화학적/물리적 구조 연구 및 확보 (circular RNA, RNA origami structure) ◎ 구축된 합성 mRNA의 세포 내 단백질 발현 효율, 장기 지속 효과, 및 면역 반응 조절 효과에 대한 검증◎ 세포 내 타겟 단백질 발현 감소를 기반으로 리보핵산 구조체의 in vitro 침묵효과 확인2차년도◎ 생체 내 효소(GSH)에 의해 분해 가능한 이온화 지질 합성◎ pKa 측정을 통한 이온화 지질의 엔도좀 탈출 효과 평가◎ In vitro 세포 실험을 통한 이온화 지질물질의 독성평가◎ 초미세유체장치를 이용한 이온화 지질 나노입자 생산 및 최적화 (120 nm 이하, 봉입률 90% 이상, 및 균질도 확보)◎ 이온화 지질 나노입자를 이용한 기질 리보핵산의 세포 내 전달 및 이를 통한 유전자 침묵 및 발현여부 확인◎ 생분해성 이온화 지질 나노입자의 in vivo biodistribution 확인 및 비분해성 지질 나노입자와의 독성비교 평가◎ 특정 입자 크기의 이온화 지질 나노입자의 제조 및 평가◎ 나노입자의 물리적 특성에 따른 표적 전달기술 확보◎ 친수성 고분자 함량비에 따른 체내동태 (PK&BD) 확인 ◎ 생물학적 리간드(Mannose)가 수식된 이온화 지질 나노 입자 개발 및 이를 통한 세포 선택적 전달기술 확보 3차년도◎ 유전자 침묵치료 (hepatocytes): HBV 동물모델에서 pgRNA를 타겟으로 한 다이서 기질 리보핵산 구조체의 유전자 침묵효과 확보 및 혈중 HBsAg 감소 확인 ◎ 유전자 발현치료 (LSEC): 리간드 수식 지질 나노입자를 이용한 FVIII mRNA 의 LSEC 특이적 전달 및 혈중 FVIII 농도 측정을 통한 치료효과를 혈우병 동물모델에서 확인◎ 유전자 침묵치료 (Lung epithelial cells): Pulmonary Disease 모델에서의 CTGF 유전자 침묵을 통한 lung fibrosis 억제효과 확인◎ 유전자 발현치료 (inflammatory leukocytes): 다중 단백질 발현 mRNA를 기반으로 한 anti-inflammatory protein (IL10, TGF-b) 의 Ly6+Luekocytes 특이적 전달 및 면역 억제효과 확인

본 연구팀에서 제안하는 '기질 리보핵산 구조 연구를 통한 혁신적 유전자치료제 개발'이 성공적으로 수행되면, 기존 리보핵산 치료제의 한계를 뛰어넘어 다양한 만성질환 및 유전질환의 치료를 앞당길 수 있을 것으로 기대됨. 아래에는 기술적 측면 및 경제적/산업적 측면에 대한 기대효과를 기술함.(1) 기술적 측면◎ 기질 리보핵산의 구조 연구를 통해 타겟 단백질과의 상호작용 최적화에 대한 원천기술을 확보함으로서, 기존 핵산 기반 바이오 의약품의 한계를 극복하고 질병의 원인을 근본적으로 치료할 수 있음. ◎ 체내 선택적 약물전달기술은 표적지향성 약물전달에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 염증 및 대사질환 등 인체 내 다양한 질병치료에 이용될 수 있는 획기적인 원천기술로서, 꾸준히 성장하고 있는 바이오/제약시장에서 우위를 차지하고 내분비질환 및 암 뿐만 아니라 다양한 바이러스성 질환에 적용할 수 있을 것임.(2) 경제적/산업적 측면◎ 경제적인 가치 면에서는 앞서 제시된 세포치료제, 유전자치료제 및 악성 종양치료제 및 B/C 형 간염 치료제의 현재 시장 규모가 연간 수백억 달러임을 감안할 때, 기질 리보핵산 구조 연구를 통해 최적화된 핵산 치료제 제조 및 약물전달기술은 관련 분야 시장에 미칠 파급효과가 매우 클 것으로 판단됨. ◎ 또한 관련 기술을 이용하여, 세계 시장에서의 우위를 점할 수 있을 것임. 이는 국가에서 최근 신성장 동력 중 하나로 선정한 나노기술을 바탕으로 한 “바이오 제약·의료기기” 분야에서의 새로운 기술 개발 및 경제적 가치 창출과도 부합한다고 볼 수 있음.

비바이러스성 유전자 치료제의 한계를 극복하기 위해 1) 기질 리보핵산(Dicer substrate RNA and synthetic mRNA)의 화학적/물리적 구조에 대한 연구를 진행하여 세포 내 단백질과의 상호작용을 최적화하고, 2) 기질 리보핵산의 생체 내 전달을 위해 생분해성 이온화 지질 나노입자(ionizable solid lipid nanoparticles)를 개발 하여 혁신적 유전자 치료 효과를 얻는 것을 최종목표로 한다.세부목표는 다음과 같다.◎ 다이서 기질 리보핵산 구조체의 화학적/물리적 구조 변경을 통한 단백질과의 상호작용 평가.◎ 다이서 기질 리보핵산 구조체의 향상된 in vitro 및 in vivo 유전자 침묵효과 확보.◎ 리보좀 기질 합성 mRNA (in vitro transcripted mRNA) 제작 및 세포 내 다중 단백질 발현 확인.◎ 합성 mRNA의 화학적/물리적 구조 변경을 통한 장기적인 단백질 발현(long term expression) 시스템 개발. ◎ 기질 리보핵산의 세포 내 전달을 위한 생분해성(bioreducible) 이온화 지질 합성 및 세포 독성 평가.◎ 초미세유체장치를 이용한 이온화 지질 나노입자 포뮬레이션 개발 및 고효율의 기질 리보핵산 봉입률 확보. ◎ 이온화 지질 나노입자의 물리적 특성 및 생물학적 리간드 수식을 이용한 체내 선택적 전달기술 개발.◎ 기질 리보핵산 전달을 통한 유전자 억제 및 발현에 따른 치료효과를 소동물 실험을 통해 확인.

연차별 연구내용은 다음과 같다.1차년도◎ 다이서 기질로서의 리보핵산 구조체의 조건 확립 ◎ Thermal Annealing을 통한 리보핵산 구조체 제작◎ 기질 리보핵산 구조체의 다이서 프로세싱 여부 확인 ◎ Fluorescence polarization(FP) assay를 통한 기질 리보핵산과 단백질 간의 결합 확인◎ FP assay를 기반으로 한 리보핵산 구조의 화학적 변형 패턴 및 물리적 구조 최적화를 통한 침묵효능 극대화◎ In vitro 세포 실험을 통한 안정성 및 침묵효능 평가◎ 다양한 종류의 5' CAP, 5' 3'-UTR, poly A tail을 가진 mRNA 구조 연구 및 라이브러리 구축◎ 다중 단백질 전사를 위한 IRES 서열 및 2A peptide 서열의 스크리닝 및 최적 서열 확보◎ IVT mRNA의 다중 단백질 전사 효율을 in vitro에서 검증◎ mRNA의 세포 내 안정도 증가 및 면역 반응 조절을 위한 chem. modified rNTP 적용 ◎ 세포 내 단백질 발현을 장기간 지속하기 위한 새로운 합성 mRNA의 화학적/물리적 구조 연구 및 확보 (circular RNA, RNA origami structure) ◎ 구축된 합성 mRNA의 세포 내 단백질 발현 효율, 장기 지속 효과, 및 면역 반응 조절 효과에 대한 검증◎ 세포 내 타겟 단백질 발현 감소를 기반으로 리보핵산 구조체의 in vitro 침묵효과 확인2차년도◎ 생체 내 효소(GSH)에 의해 분해 가능한 이온화 지질 합성◎ pKa 측정을 통한 이온화 지질의 엔도좀 탈출 효과 평가◎ In vitro 세포 실험을 통한 이온화 지질물질의 독성평가◎ 초미세유체장치를 이용한 이온화 지질 나노입자 생산 및 최적화 (120 nm 이하, 봉입률 90% 이상, 및 균질도 확보)◎ 이온화 지질 나노입자를 이용한 기질 리보핵산의 세포 내 전달 및 이를 통한 유전자 침묵 및 발현여부 확인◎ 생분해성 이온화 지질 나노입자의 in vivo biodistribution 확인 및 비분해성 지질 나노입자와의 독성비교 평가◎ 특정 입자 크기의 이온화 지질 나노입자의 제조 및 평가◎ 나노입자의 물리적 특성에 따른 표적 전달기술 확보◎ 친수성 고분자 함량비에 따른 체내동태 (PK&BD) 확인 ◎ 생물학적 리간드(Mannose)가 수식된 이온화 지질 나노 입자 개발 및 이를 통한 세포 선택적 전달기술 확보 3차년도◎ 유전자 침묵치료 (hepatocytes): HBV 동물모델에서 pgRNA를 타겟으로 한 다이서 기질 리보핵산 구조체의 유전자 침묵효과 확보 및 혈중 HBsAg 감소 확인 ◎ 유전자 발현치료 (LSEC): 리간드 수식 지질 나노입자를 이용한 FVIII mRNA 의 LSEC 특이적 전달 및 혈중 FVIII 농도 측정을 통한 치료효과를 혈우병 동물모델에서 확인◎ 유전자 침묵치료 (Lung epithelial cells): Pulmonary Disease 모델에서의 CTGF 유전자 침묵을 통한 lung fibrosis 억제효과 확인◎ 유전자 발현치료 (inflammatory leukocytes): 다중 단백질 발현 mRNA를 기반으로 한 anti-inflammatory protein (IL10, TGF-b) 의 Ly6+Luekocytes 특이적 전달 및 면역 억제효과 확인

본 연구팀에서 제안하는 '기질 리보핵산 구조 연구를 통한 혁신적 유전자치료제 개발'이 성공적으로 수행되면, 기존 리보핵산 치료제의 한계를 뛰어넘어 다양한 만성질환 및 유전질환의 치료를 앞당길 수 있을 것으로 기대됨. 아래에는 기술적 측면 및 경제적/산업적 측면에 대한 기대효과를 기술함.(1) 기술적 측면◎ 기질 리보핵산의 구조 연구를 통해 타겟 단백질과의 상호작용 최적화에 대한 원천기술을 확보함으로서, 기존 핵산 기반 바이오 의약품의 한계를 극복하고 질병의 원인을 근본적으로 치료할 수 있음. ◎ 체내 선택적 약물전달기술은 표적지향성 약물전달에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 염증 및 대사질환 등 인체 내 다양한 질병치료에 이용될 수 있는 획기적인 원천기술로서, 꾸준히 성장하고 있는 바이오/제약시장에서 우위를 차지하고 내분비질환 및 암 뿐만 아니라 다양한 바이러스성 질환에 적용할 수 있을 것임.(2) 경제적/산업적 측면◎ 경제적인 가치 면에서는 앞서 제시된 세포치료제, 유전자치료제 및 악성 종양치료제 및 B/C 형 간염 치료제의 현재 시장 규모가 연간 수백억 달러임을 감안할 때, 기질 리보핵산 구조 연구를 통해 최적화된 핵산 치료제 제조 및 약물전달기술은 관련 분야 시장에 미칠 파급효과가 매우 클 것으로 판단됨. ◎ 또한 관련 기술을 이용하여, 세계 시장에서의 우위를 점할 수 있을 것임. 이는 국가에서 최근 신성장 동력 중 하나로 선정한 나노기술을 바탕으로 한 “바이오 제약·의료기기” 분야에서의 새로운 기술 개발 및 경제적 가치 창출과도 부합한다고 볼 수 있음.

비바이러스성 유전자 치료제의 한계를 극복하기 위해 1) 기질 리보핵산(Dicer substrate RNA and synthetic mRNA)의 화학적/물리적 구조에 대한 연구를 진행하여 세포 내 단백질과의 상호작용을 최적화하고, 2) 기질 리보핵산의 생체 내 전달을 위해 생분해성 이온화 지질 나노입자(ionizable solid lipid nanoparticles)를 개발 하여 혁신적 유전자 치료 효과를 얻는 것을 최종목표로 한다.세부목표는 다음과 같다.◎ 다이서 기질 리보핵산 구조체의 화학적/물리적 구조 변경을 통한 단백질과의 상호작용 평가.◎ 다이서 기질 리보핵산 구조체의 향상된 in vitro 및 in vivo 유전자 침묵효과 확보.◎ 리보좀 기질 합성 mRNA (in vitro transcripted mRNA) 제작 및 세포 내 다중 단백질 발현 확인.◎ 합성 mRNA의 화학적/물리적 구조 변경을 통한 장기적인 단백질 발현(long term expression) 시스템 개발. ◎ 기질 리보핵산의 세포 내 전달을 위한 생분해성(bioreducible) 이온화 지질 합성 및 세포 독성 평가.◎ 초미세유체장치를 이용한 이온화 지질 나노입자 포뮬레이션 개발 및 고효율의 기질 리보핵산 봉입률 확보. ◎ 이온화 지질 나노입자의 물리적 특성 및 생물학적 리간드 수식을 이용한 체내 선택적 전달기술 개발.◎ 기질 리보핵산 전달을 통한 유전자 억제 및 발현에 따른 치료효과를 소동물 실험을 통해 확인.

연차별 연구내용은 다음과 같다.1차년도◎ 다이서 기질로서의 리보핵산 구조체의 조건 확립 ◎ Thermal Annealing을 통한 리보핵산 구조체 제작◎ 기질 리보핵산 구조체의 다이서 프로세싱 여부 확인 ◎ Fluorescence polarization(FP) assay를 통한 기질 리보핵산과 단백질 간의 결합 확인◎ FP assay를 기반으로 한 리보핵산 구조의 화학적 변형 패턴 및 물리적 구조 최적화를 통한 침묵효능 극대화◎ In vitro 세포 실험을 통한 안정성 및 침묵효능 평가◎ 다양한 종류의 5' CAP, 5' 3'-UTR, poly A tail을 가진 mRNA 구조 연구 및 라이브러리 구축◎ 다중 단백질 전사를 위한 IRES 서열 및 2A peptide 서열의 스크리닝 및 최적 서열 확보◎ IVT mRNA의 다중 단백질 전사 효율을 in vitro에서 검증◎ mRNA의 세포 내 안정도 증가 및 면역 반응 조절을 위한 chem. modified rNTP 적용 ◎ 세포 내 단백질 발현을 장기간 지속하기 위한 새로운 합성 mRNA의 화학적/물리적 구조 연구 및 확보 (circular RNA, RNA origami structure) ◎ 구축된 합성 mRNA의 세포 내 단백질 발현 효율, 장기 지속 효과, 및 면역 반응 조절 효과에 대한 검증◎ 세포 내 타겟 단백질 발현 감소를 기반으로 리보핵산 구조체의 in vitro 침묵효과 확인2차년도◎ 생체 내 효소(GSH)에 의해 분해 가능한 이온화 지질 합성◎ pKa 측정을 통한 이온화 지질의 엔도좀 탈출 효과 평가◎ In vitro 세포 실험을 통한 이온화 지질물질의 독성평가◎ 초미세유체장치를 이용한 이온화 지질 나노입자 생산 및 최적화 (120 nm 이하, 봉입률 90% 이상, 및 균질도 확보)◎ 이온화 지질 나노입자를 이용한 기질 리보핵산의 세포 내 전달 및 이를 통한 유전자 침묵 및 발현여부 확인◎ 생분해성 이온화 지질 나노입자의 in vivo biodistribution 확인 및 비분해성 지질 나노입자와의 독성비교 평가◎ 특정 입자 크기의 이온화 지질 나노입자의 제조 및 평가◎ 나노입자의 물리적 특성에 따른 표적 전달기술 확보◎ 친수성 고분자 함량비에 따른 체내동태 (PK&BD) 확인 ◎ 생물학적 리간드(Mannose)가 수식된 이온화 지질 나노 입자 개발 및 이를 통한 세포 선택적 전달기술 확보 3차년도◎ 유전자 침묵치료 (hepatocytes): HBV 동물모델에서 pgRNA를 타겟으로 한 다이서 기질 리보핵산 구조체의 유전자 침묵효과 확보 및 혈중 HBsAg 감소 확인 ◎ 유전자 발현치료 (LSEC): 리간드 수식 지질 나노입자를 이용한 FVIII mRNA 의 LSEC 특이적 전달 및 혈중 FVIII 농도 측정을 통한 치료효과를 혈우병 동물모델에서 확인◎ 유전자 침묵치료 (Lung epithelial cells): Pulmonary Disease 모델에서의 CTGF 유전자 침묵을 통한 lung fibrosis 억제효과 확인◎ 유전자 발현치료 (inflammatory leukocytes): 다중 단백질 발현 mRNA를 기반으로 한 anti-inflammatory protein (IL10, TGF-b) 의 Ly6+Luekocytes 특이적 전달 및 면역 억제효과 확인

본 연구팀에서 제안하는 '기질 리보핵산 구조 연구를 통한 혁신적 유전자치료제 개발'이 성공적으로 수행되면, 기존 리보핵산 치료제의 한계를 뛰어넘어 다양한 만성질환 및 유전질환의 치료를 앞당길 수 있을 것으로 기대됨. 아래에는 기술적 측면 및 경제적/산업적 측면에 대한 기대효과를 기술함.(1) 기술적 측면◎ 기질 리보핵산의 구조 연구를 통해 타겟 단백질과의 상호작용 최적화에 대한 원천기술을 확보함으로서, 기존 핵산 기반 바이오 의약품의 한계를 극복하고 질병의 원인을 근본적으로 치료할 수 있음. ◎ 체내 선택적 약물전달기술은 표적지향성 약물전달에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 염증 및 대사질환 등 인체 내 다양한 질병치료에 이용될 수 있는 획기적인 원천기술로서, 꾸준히 성장하고 있는 바이오/제약시장에서 우위를 차지하고 내분비질환 및 암 뿐만 아니라 다양한 바이러스성 질환에 적용할 수 있을 것임.(2) 경제적/산업적 측면◎ 경제적인 가치 면에서는 앞서 제시된 세포치료제, 유전자치료제 및 악성 종양치료제 및 B/C 형 간염 치료제의 현재 시장 규모가 연간 수백억 달러임을 감안할 때, 기질 리보핵산 구조 연구를 통해 최적화된 핵산 치료제 제조 및 약물전달기술은 관련 분야 시장에 미칠 파급효과가 매우 클 것으로 판단됨. ◎ 또한 관련 기술을 이용하여, 세계 시장에서의 우위를 점할 수 있을 것임. 이는 국가에서 최근 신성장 동력 중 하나로 선정한 나노기술을 바탕으로 한 “바이오 제약·의료기기” 분야에서의 새로운 기술 개발 및 경제적 가치 창출과도 부합한다고 볼 수 있음.