1. 1차년도 연구 -미세먼지와 저농도의 항원의 투여로 천식 발생 유도마우스 모델 확립과 IL-23 의 역할 확인 1) 미세먼지와 저농도 항원투여시 마우스 모델의 확립 및 기도상피세포에서의 IL-23 분비 변화 확인: 예비실험에서 저농도의 항원 (Der p 10ug/mouse) 과 미세먼지 (20ug/mouse) 를 2주 동안 intranasal route 로 투여함으로 천식마우스의 유도를 확인하였다. 따라서, PM으로 인한 영향임을 증명하기 위해 PM 농도를 더 높여 2 dose 로 실험을 하여 dose kinetic effect를 보이는지에 대해 여러 평가지표를 살펴본다. Evaluation-1) 예비실험을 통해 관련성이 높게 보이는 DC activation, adaptive immune response 인 Th2, innate immune response 인 ILC2 가 타겟이며 관련 cytokine (IL-33, TSLP, IL-25..), DC activation 및 관련 cytokine (GM-CSF, IL-1a, IL-6..) 도 함께 살펴본다. Evaluation-2) 이 과정에서 기도상피세포에서의 IL-23 의 분비 변화 및 위의 언급된 cytokine (IL-33, TSLP et al...) 들의 발현도 함께 확인한다. Evaluation-3) PM 으로 인한 DC migration 영향을 확인한다.2) 확립된 마우스 모델에서 IL-23 억제의 영향 확인PM 농도가 확립된 마우스 모델에서 IL-23 의 역할을 알아보기 위해 anti-IL23p19 antibody (R&D, 0.5ug/mouse) 를 intranasal route 로 함께 투여하여 Evaluation-1) 의 지표들의 변화를 확인한다.2. 2차년도 연구- 동물 모델에서 나온 결과를 바탕으로 이에 관련된 기전을 기도상피세포수준에서 증명하고자 함. 가) Co-culture of bronchial epithelial cell with ILC2 or BMDC-가1) Bronchial epithelial cell line 배양 연구: 우선 mouse bronchial epithelial cell line 인 MLE12 cell 을 이용하여 PM (10-100ug/ml) + low dose HDM (Der p 1-10ug/ml) 자극을 주어 ① 수지상세포의 활성화에 관련된 인자들과 ILC2 의 활성화에 관련된 인자들을 측정한다. ② 이 과정에서 IL-23 or IL-23R siRNA 를 처리해 각각의 역할을 살펴본다. ③ IL-23 에 억제에 의한 위의 사이토카인들의 발현이 조절되는지 알아보기 위해 관여하는 signaling pathway 에 대해 전혀 연구된바 없으므로 관련성이 있을 것으로 예측되는 transcriptional factor 의 활성화를 각 phospho type 의 antibody로 western blot 으로 확인해 보고자 한다. 또한 ④ PM 으로 인한 tight junction disruption 에도 변화가 있는지 확인한다.이 후 ILC2 의 분리와 BMDC 의 분화를 거친 후 위 자극물질이 처리된 MLE-12 cell 과 co-culture를 시행한다. 3. 3차년도 연구-1~2차년도의 결과를 바탕으로 neonatal 마우스를 이용하여 어린 시기의 미세먼지와 저농도의 항원 노출시 시기별로 천식의 발생의 영향을 확인하고 이 과정에서 IL-23 의 억제 효과도 함께 규명하고자 함.1) neonatal 마우스를 이용해 어린시기의 저농도의 항원과 미세먼지의 노출로 인한 성장기 천식발생의 영향 확인 및 기도상피세포에서의 IL-23 분비 변화 및 억제의 영향 확인: 임신 마우스 (BALB/c) 를 구입해서 낳은 개체로 생후 7일째부터 PM 과 저농도의 Dp를 투여한다. 3주 투여 후 성장기 마우스 (4주령) 에서의 변화를 살펴보고, 이 과정에서 IL-23 억제 (PM 과 저농도의 Dp 와 함께 투여) 의 영향을 함께 확인해 본다. 2) 어린시기의 저농도의 항원과 미세먼지의 노출이 성인 쥐에서의 항원의 memory response를 일으켜 잠재적인 천식의 발생을 유도할 수 있는지 확인해 보고자 하며, 역시 IL-23 억제의 영향을 함께 확인해 본다.
